Corona: PCR-Tests bei SARS-CoV‑2

11.04.2022 | Coronavirus, Medizin

Gold­stan­dard für den Nach­weis von SARS-CoV‑2 ist das PCR-Ver­fah­ren, Referenz­methode der Nasen­ra­chen­ab­strich. Die ers­ten spe­zi­el­len Test­systeme für den PCR-Nach­weis von SARS-CoV‑2 wur­den Anfang 2020 kurz nach der ­Ent­schlüs­se­lung des Genoms ent­wi­ckelt. Mitt­ler­weile gibt es mehr als 100 ­ver­schie­dene Typen von Test-Systemen.

PCR-Test­ver­fah­ren

Das recht­zei­tige und ver­läss­li­che Iden­ti­fi­zie­ren von Per­so­nen, die mit SARS-CoV‑2 infi­ziert sind, ist seit dem Beginn der Corona-­Pan­de­mie ein zen­tra­les und unver­zicht­ba­res ­Instru­ment, um Infektions­cluster auf­zu­de­cken, Infek­ti­ons­ket­ten zu durch­bre­chen und eine Aus­brei­tung der Erkran­kung zu kon­trol­lie­ren. Gold­stan­dard für den Virus-Nach­weis ist wegen der höchs­ten Sen­si­ti­vi­tät und Spe­zi­fi­tät das PCR-Ver­fah­ren zum Nach­weis von Virus-Nukle­in­säure (RNA) aus dem Nasenrachenabstrich-Medium.

Die Poly­me­rase-Ket­ten­re­ak­tion (Poly­me­rase Chain Reac­tion, PCR) ist ein lange eta­blier­tes hoch­sen­si­ti­ves mole­ku­lar­ge­ne­ti­sches Labor­ver­fah­ren zur Ver­viel­fäl­ti­gung (Ampli­fi­zie­rung) und Cha­rak­te­ri­sie­rung von spe­zi­fi­schen Sequen­zen (Tar­gets) in Nukle­in­säu­ren. Damit ist sowohl der Nach­weis von Viren und Bak­te­rien als auch von mensch­li­chen Gen-Ver­än­de­run­gen möglich.

Soll bei­spiels­weise ein RNA-Virus nach­ge­wie­sen wer­den, muss diese Sequenz zunächst in DNA (kom­ple­men­täre DNA, cDNA) umge­schrie­ben (revers tran­skri­biert) wer­den, bevor die eigent­li­che PCR-Reak­tion begin­nen kann. Des­we­gen bezeich­net man die­ses Ver­fah­ren auch als Reverse-Tran­skrip­tion-PCR (RT-PCR). Dabei erfolgt die Ampli­fi­ka­tion übli­cher­weise in (40 bis 45) auf­ein­an­der­fol­gen­den Zyklen, wobei sich die Ziel-Gen­se­quenz durch Reagen­zien sowie bestimmte Tem­pe­ra­tur­ver­läufe in jedem Zyklus ver­dop­pelt. Mit Hilfe von Fluo­res­zenz­farb­stof­fen kann die­ser expo­nen­ti­elle Anstieg der Ziel-Sequenz kon­ti­nu­ier­lich bezie­hungs­weise in Echt­zeit („Real­time PCR“ oder quan­ti­ta­tive PCR, qPCR) detek­tiert wer­den. Je mehr vom gesuch­ten Tar­get im Aus­gangs­ma­te­rial vor­liegt, umso mehr Kopien ent­ste­hen in der zykli­schen Ampli­fi­ka­tion. Umso frü­her steigt daher auch die Fluo­res­zenz über den mess­ba­ren Schwel­len­wert, ab dem die PCR posi­tiv ausfällt.

Ct-Wert

Als Ct-Wert bezeich­net man den Zeit­punkt im Ampli­fi­zie­rungs­ver­fah­ren, an dem der Schwel­len­wert (Cycle tres­hold, Ct) über­schrit­ten wird. Die­ser Wert gibt die Anzahl der Ampli­fi­ka­ti­ons­zy­klen an, die bis zu die­sem Zeit­punkt erfolgt sind. Bei einer hohen Anzahl an Tar­get-Sequen­zen im Unter­su­chungs­ma­te­rial wird die­ser Schwel­len­wert frü­her erreicht als bei einer nied­ri­gen Anzahl. Daher ist der Ct-Wert umge­kehrt pro­por­tio­nal zur Menge der nach­ge­wie­se­nen gesuch­ten Sequenz. Im Fall einer Virus-PCR ent­spricht ein nied­ri­ger Ct-Wert einer gro­ßen Menge, ein hoher Ct-Wert hin­ge­gen einer nied­ri­gen Menge der gesuch­ten Sequenz und somit einer hohen bezie­hungs­weise einer gerin­gen Anzahl von Virus-RNA im Unter­su­chungs­ma­te­rial. Ist kein Anstieg über den Schwel­len­wert detek­tier­bar, gilt das Ergeb­nis der PCR als nega­tiv bezie­hungs­weise unter der Nachweisgrenze.

Bei labor­me­di­zi­ni­schen Ana­ly­se­ver­fah­ren unter­schei­det man drei Teilprozesse:
1) Prä­ana­ly­tik: Sie umfasst die Vor­be­rei­tung des Pro­ban­den und die Über­prü­fung sei­ner Iden­ti­tät, die Kenn­zeich­nung des Sys­tems zur Abnahme des Pro­ben­ma­te­ri­als, das Ver­fah­ren zur Pro­ben­ab­nahme, den Trans­port des gewon­ne­nen Proben­materials ins Labor, dort die Admi­nis­tra­tion der Anfor­de­rung zur Ana­lyse, die Ein­gangs­prü­fung des Pro­ben­ma­te­ri­als sowie die Zwi­schen­la­ge­rung der Pro­ben bis zum Beginn der Analytik.
2) Ana­ly­tik: Sie umfasst sämt­li­che Ver­fah­ren und Schritte für die sach­ge­mäße Durch­füh­rung des Ana­ly­se­ver­fah­rens und endet mit der Über­prü­fung der tech­ni­schen Vali­di­tät der erhal­te­nen Ergebnisse.
3) Post­ana­ly­tik: Sie umfasst die Erstel­lung des Labor­be­fun­des ebenso wie die erfor­der­li­che Ver­an­las­sung ­bezie­hungs­weise Emp­feh­lung von wei­te­ren Unter­su­chun­gen durch den Labor-­Fach­arzt sowie die Archi­vie­rung der Pro­ben­ma­te­ria­lien ­inklu­sive deren spä­tere Entsorgung.

Unter­su­chungs­ver­fah­ren

Ver­fah­ren der Probenentnahme

Typi­scher­weise erfolgt die Auf­nahme von SARS-CoV-2-Viren über die obe­ren Atem- und Schluck­wege. Diese Viren infi­zie­ren im Tier­ver­such vor allem respi­ra­to­ri­sche Epi­the­lien, Pneu­mo­zy­ten vom Typ I und II sowie Epi­the­lien der Spei­chel­drü­sen. In die­sen Zel­len erfolgt auch die Virus-Repli­ka­tion, gefolgt von der Virus-Frei­set­zung in das respi­ra­to­ri­sche Sekret bezie­hungs­weise in den Spei­chel. Die frei gesetz­ten Viren kön­nen dann im Nasen­vor­hof, in der Nasen­haupt­höhle, im Nasen­ra­chen, im Oro­pha­rynx und im Spei­chel der Mund­höhle nach­ge­wie­sen werden.

Am höchs­ten ist der Virus-Load der obe­ren Atem- und Schluck­wege – gemes­sen an der PCR-Zyklus­zahl – im pha­ryn­gea­len Bereich, gefolgt von der Nasen­haupt­höhle und der Mund­höhle. Bei pul­mo­na­ler Betei­li­gung ist auch ein hoher Virus-Load im Spu­tum nachweisbar.

Für die Pro­ben­ge­win­nung aus dem Nasen­vor­hof, der Nasen­haupt­höhle, dem Nasen­ra­chen und dem Mund­ra­chen eig­net sich ein Abstrich mit dün­nen Wat­te­trä­gern; für die Gewin­nung einer Spei­chel­probe aus der Mund­höhle eine Mund­spü­lung. Dabei sol­len vor allem keine Wat­te­trä­ger mit höl­zer­nem Stiel ver­wen­det wer­den. Refe­renz­me­thode für den Nach­weis von SARS-CoV‑2 ist der Nasenrachenabstrich.

Nasen­vor­hof­ab­strich, Nasen­ab­strich und Nasen­ra­chen­ab­strich

• Nasen­vor­hof­ab­strich
Ein Abstrich aus dem Nasen­vor­hof wir auch Ante­rio-nasal-Test, Nasen­boh­rer­test oder Ante­rior nares swab bezeich­net. Er eig­net sich zum Selbst­test und ist für Kin­der gut geeig­net. Der Watte­träger wird im Sit­zen einen Zen­ti­me­ter tief in den Nasen­vor­hof ein­ge­führt und mehr­fach kreis­för­mig bewegt. Die Sen­si­ti­vi­tät (Nach­weis­grenze) beträgt circa 80 Pro­zent des Nasen­ra­chen­ab­strichs (Refe­renz­me­thode).


HINWEIS: Die wesent­li­che Feh­ler­quelle ist, dass der Wat­te­trä­ger zu tief ein­ge­führt wird – ins­be­son­dere, wenn Kin­der wäh­rend der Abstri­ch­ent­nahme her­um­lau­fen und stürzen.


• Nasen- und Nasenrachenabstrich
Der Nasen­ab­strich wird auch als mid-tur­bi­nate swab bezeich­net; der Nasen­ra­chen­ab­strich als nasopha­ryn­gea­ler Swab. ­Diese bei­den Abstri­che soll­ten von medi­zi­ni­schem Fach­personal ent­nom­men wer­den. Erfor­der­lich sind geeig­nete Schutz­klei­dung, FFP2-Maske, Schutz­brille oder Gesichts­schild sowie Unter­suchungshandschuhe. Eine Licht­quelle schräg hin­ter dem Unter­sucher ist günstig.

Unter­su­cher und Pro­band sol­len beim Abstrich „auf Augen­höhe“ sein: Ent­we­der soll­ten beide ste­hen oder beide sit­zen. Anders als das Cen­ter for Dise­ase Con­trol and Pre­ven­tion emp­feh­len die Autoren nicht, dass der Pro­band den Kopf um 70 Grad nach rück­wärts neigt, weil dann der Wat­te­trä­ger leicht zu steil nach supe­rior in die Nase ein­ge­führt wird. Die Emp­feh­lung lau­tet: Der Pro­band soll den Kopf waag­recht hal­ten, um den Watte­träger ein­zu­füh­ren. Mit dem Dau­men wird die Nasen­spitze leicht ange­ho­ben und leicht auf die Seite dis­lo­ziert, auf der der Abstrich erfol­gen soll. Dann wird der Wat­te­trä­ger hori­zon­tal und para­me­dian sagit­tal ent­lang des Nasen­bo­dens ein­ge­führt, lang­sam zwei- bis drei­mal nach rechts und links gedreht und dann herausgezogen.

Beim Erwach­se­nen beträgt die Ein­dring­tiefe für den Nasen­ab­strich drei Zen­ti­me­ter, für den Nasen­ra­chen­ab­strich fünf Zen­ti­me­ter; bei Kin­dern ist es jeweils ein Zen­ti­me­ter weni­ger. Reflek­to­risch kann es zum Nie­sen und Trä­nen­fluss kommen.

Die Sen­si­ti­vi­tät des Nasen­ab­strichs beträgt rund 80 Pro­zent des Nasen­ra­chen­ab­strichs (Refe­renz­me­thode) und war in meh­re­ren Unter­su­chun­gen auch nicht bes­ser als jene des Nasen­vor­hof­ab­strichs. Jedoch ist der Nasen­ab­strich deut­lich belas­ten­der als der Nasenvorhofabstrich.


HINWEIS: Typi­sche Fehler
• Der Wat­te­trä­ger wird nicht hori­zon­tal nach hin­ten, son­dern schräg nach oben geführt. Es muss­ten bereits abge­bro­chene Anteile von Wat­te­trä­gern aus den Weich­tei­len des Nasen­rü­ckens ent­fernt werden. 
• Der Wat­te­trä­ger wird gegen einen Wider­stand mit Druck nach hin­ten gescho­ben. Stößt man auf einen Wider­stand, ein­fach die andere Nasen­seite neh­men oder einen Mund­rachenabstrich durchführen. 
• Ungüns­tige Licht­ver­hält­nisse, beson­ders Gegenlicht. 
• Der Pro­band neigt den Kopf zu weit nach hin­ten, wodurch der Wat­te­trä­ger eine fal­sche Rich­tung nach supe­rior erhält. Kinn in Rich­tung Brust senken. 
• Die Nasen­spitze wird nicht ange­ho­ben, der Über­gang vom Nasen­vorhof in die Nasen­haupt­höhle kann nicht visua­li­siert werden.
• Wat­te­trä­ger wird nicht aus­rei­chend tief eingeführt.


• Mund­ra­chen­ab­strich
Für die­sen Abstrich sol­len die Wat­te­trä­ger des Her­stel­lers ver­wen­det wer­den; es kön­nen jedoch auch die glei­chen Wat­te­trä­ger wie für den Nasen­ra­chen­ab­strich ver­wen­det werden.

Man lässt den Pro­ban­den den Mund öff­nen, loka­li­siert das Zäpf­chen und von die­sem aus­ge­hend nach late­ral den vor­de­ren Gau­men­bo­gen. Dann führt man den Wat­te­trä­ger hin­ter dem vor­de­ren Gau­men­bo­gen auf die late­rale Rachen­wand, dreht den Wat­te­trä­ger zwei- bis drei­mal hin und her und zieht ihn wie­der heraus.

Häu­fig ver­de­cken die Pro­ban­den die Rache­nenge durch unbe­wuss­tes und unwill­kür­li­ches Anhe­ben der Zunge, sodass man das Zäpf­chen und den vor­de­ren Gau­men­bo­gen nicht erken­nen kann. Die Atmung erfolgt dabei durch die Nase. In die­sem Fall bit­tet man den Pro­ban­den, sich die Nase mit einer Hand zuzu­hal­ten und durch den Mund zu atmen. In dem Moment, in dem die Mund­at­mung ein­setzt, fällt die Zunge nach unten, das Isth­mus fau­cium öff­net sich: Man kann das Zäpf­chen und den vor­de­ren Gau­men­bo­gen gut erken­nen und den Abstrich ­gewin­nen. Manch­mal ist auch ein Holz­spa­tel not­wen­dig, um die Zunge her­un­ter zu drü­cken. Oft ist auch bei Mund­atmung ein Mund­ra­chen­ab­strich unter visu­el­ler Kon­trolle nicht mög­lich. In die­sem Fall kann eine Mund­spü­lung (Gur­gel­test) durch­ge­führt wer­den oder ein Nasen­ra­chen­ab­strich ent­nom­men werden.


HINWEIS: Feh­ler­quelle – Der Abstrich erfolgt aus der Mund­höhle und nicht aus dem Mundrachen.


• Mund­spü­lung
Mund­spü­lun­gen wer­den für Unter­su­chun­gen am Mund­spei­chel ver­wen­det, wobei die Spül­lö­sung mit dem Mund­spei­chel ver­mischt wird. Beim soge­nann­ten Gur­gel­test han­delt es sich nur um eine Mundspülung.

Es ist ein weit ver­brei­te­ter Irr­tum, dass Gur­gel­lö­sun­gen in den Mund­ra­chen gelan­gen. Unter­su­chun­gen in den 1970er Jah­ren in Groß­bri­tan­nien mit ungif­ti­ger Farb­stoff­lö­sung haben gezeigt, dass die Gur­gel­lö­sung aus­schließ­lich die Mund­schleim­haut benetzt und nicht in den Rachen gelangt. Dem­nach bie­tet das Gur­geln gegen­über dem Umwäl­zen der Spül­flüs­sig­keit in der Mund­höhle zur best­mög­li­chen Ver­mi­schung mit dem Mund­höh­len­spei­chel keine Vorteile.

Die Spül­lö­sung – meist eine Koch­salz­lö­sung – wird ähn­lich wie bei einer Wein­probe mehr­mals in der Mund­höhle hin- und her- bewegt, anschlie­ßend mit Hilfe eines Trans­fer­röhr­chens – ähn­lich einem groß­vo­lu­mi­gen Trink­halm – in ein Pro­ben­röhr­chen über­tra­gen. Die Mund­spü­lung eig­net sich zur Selbsttestung.


HINWEIS: Feh­ler­quel­len
• Es wird zu wenig Spül­lö­sung ver­wen­det, also die vor­ge­se­hene Menge wird nicht voll­stän­dig in den Mund genommen. 
• Die Mund­spü­lung wird nicht aus­rei­chend lang durch­geführt (je nach Her­stel­ler­an­ga­ben meist eine Minute).


Poo­len von Proben

Beim Poolen/​Pooling wer­den Teile von Ein­zel­pro­ben ­manu­ell oder von einem Robo­ter in einem Gefäß ver­mischt und als „Proben­pool“ zur Ana­lyse gebracht. Mit der gleich­zei­ti­gen ­Ana­lyse von meh­re­ren Pro­ben in einem Pro­ben­an­satz (Pool) kön­nen Reagen­zien ein­ge­spart und der Pro­ben­durch­satz erhöht werden.

Fällt ein Pro­ben­pool einer SARS-CoV-2-PCR posi­tiv aus, müs­sen alle in die­sem Pool zusam­men­ge­fass­ten Pro­ben ein­zeln ana­ly­siert wer­den. Dazu ist es not­wen­dig, dass ein Teil der pri­mä­ren Pati­en­ten­probe als „Rück­stell­probe“ wei­ter­hin ein­zeln ver­füg­bar gehal­ten wird. Je nach der Größe des Pools ist dabei mit einem Ver­lust an ana­ly­ti­scher Sen­si­ti­vi­tät zu rech­nen: Bei gro­ßen Pro­ben­pools ist sie hoch, bei klei­nen Pro­ben­pools gering. Aller­dings wei­sen alle prak­ti­schen Erfah­run­gen und bis­he­rige wis­sen­schaft­li­che Publi­ka­tio­nen dar­auf hin, dass bei Poo­ling­ver­fah­ren Assays mit einer hohen Sen­si­ti­vi­tät (nied­ri­ger Nach­weis­grenze) ver­wen­det wer­den müssen.

Aktu­ell gibt es keine Emp­feh­lun­gen des Gesund­heits­mi­nis­te­ri­ums zur Anzahl der Ein­zel­pro­ben in Pools. Laut Bun­des­be­schaf­fungs-GmbH lie­gen die Poolgrö­ßen in öffent­li­chen Ver­ga­ben der­zeit zwi­schen fünf und zehn. Sie wer­den vom jewei­li­gen öffent­li­chen Auf­trag­ge­ber unter Berück­sich­ti­gung der aktu­el­len Inzi­denz festgelegt.

Ana­ly­tik

Kurz nach der Ent­schlüs­se­lung des SARS-CoV-2-Genoms Anfang 2020 entwickel­ten die Labo­ra­to­rien erste eigene Test­sys­teme für den PCR-Nach­weis von SARS-CoV‑2. In wei­te­rer Folge kamen kom­mer­zi­ell her­ge­stellte Test­sys­teme für SARS-CoV-2-RT-qPCR auf den Markt.

Im medi­zi­ni­schen Set­ting unter­schei­det man prin­zi­pi­ell Labor-PCR-Sys­teme von Sys­te­men zur pati­en­ten­na­hen Sofort­dia­gnos­tik (Point of care; POCT). Labor-PCR-Sys­teme wer­den aus­schließ­lich im medi­zi­ni­schen Fach­la­bor betrie­ben, wobei die erfor­der­li­chen Arbeits­schritte in ver­schie­de­nem Aus­maß auto­ma­ti­siert durch­ge­führt wer­den. POCT-Sys­teme sind defi­niert als Unter­su­chun­gen, die ohne Pro­ben­vor­be­rei­tung unmit­tel­bar als Ein­zel­pro­ben­mes­sun­gen in einem geschlos­se­nen Sys­tem erfol­gen. Aus den Ergeb­nis­sen wer­den unver­züg­lich wei­tere dia­gnos­ti­sche oder the­ra­peu­ti­sche Kon­se­quen­zen abgeleitet.

Moderne SARS-CoV-2-Test­sys­teme ver­wen­den für das SARS-CoV‑2 typi­sche Tar­gets wie das E‑, N‑, S‑, ORF1ab- und/​oder das RdRp-Gen. In der Regel wer­den in einer PCR meh­rere Tar­gets gleich­zei­tig nach­ge­wie­sen, um die Aus­sa­ge­kraft der Methode zu erhö­hen. So wird das Risiko mini­miert, dass durch natür­lich auf­tre­tende Muta­tio­nen die Virus-Sequenz der­art stark ver­än­dert wer­den könnte, dass sie bei Ver­wen­dung eines ein­zel­nen Tar­gets unter Umstän­den dem PCR-Nach­weis ent­ge­hen könnte. Durch meh­rere Tar­gets wird eine höchst­mög­li­che Spe­zi­fi­tät erreicht, indem ver­hin­dert wird, dass eine Gen­se­quenz, die auch bei ande­ren eng ver­wand­ten Viren inner­halb der Corona-Virus-Fami­lie vor­han­den ist, erfasst und zu einem falsch posi­ti­ven Ergeb­nis füh­ren würde.

Im Gegen­satz zu sero­lo­gi­schen Unter­su­chun­gen (Anti­kör­per-Nach­weis) ist die PCR-Ana­ly­tik unpro­ble­ma­tisch im Hin­blick auf Kreuz­re­ak­tio­nen. Bei der PCR-Ana­ly­tik sind bei kor­rek­ter Durch­füh­rung allen­falls prä­ana­ly­tisch falsch nega­tive (auf­grund der dif­fi­zi­len Abnah­me­tech­nik), jedoch kaum falsch posi­tive Befunde zu erwar­ten, sofern ent­spre­chende Hygie­ne­maß­nah­men ein­ge­hal­ten werden.

Interne PCR-Kon­troll­me­cha­nis­men

Für die Über­wa­chung von ein­zel­nen Ana­ly­sen­gän­gen ampli­fi­zie­ren man­che Test­sys­teme neben den für SARS-CoV‑2 spe­zi­fi­schen Tar­gets auch wei­tere Gen-Sequen­zen, die ent­we­der Bestand­teil des Test­kits sind oder aus dem Pro­ben­ma­te­rial stam­men. Ers­tere über­prü­fen aus­schließ­lich die tech­nisch kor­rekte Durch­füh­rung des ein­zel­nen Ana­lyse-Durch­gangs und somit die Vali­di­tät der Ergeb­nisse. Ist das Ergeb­nis der Ampli­fi­ka­tion die­ser inter­nen Kon­trolle nega­tiv, ist das Test­ergeb­nis nicht beur­teil­bar und der ­Ana­ly­sel­auf muss wie­der­holt wer­den. Zwei­tere hin­ge­gen ver­wen­den uni­ver­selle mensch­li­che Gen­se­quen­zen aus Schleim­haut­zel­len. Diese wer­den bei der Mate­ri­al­ab­nahme mit­tels Abstrich­tup­fer oder Gur­geln eben­falls ent­nom­men. Sie gel­ten auch als Nach­weis dafür, dass eine unter­suchte Probe tat­säch­lich von einem Men­schen abge­nom­men wurde. Dies ist beson­ders dann vor­teil­haft, wenn die Pro­ben­ent­nahme wie bei den Gur­gel­tests selbst­stän­dig und ohne Auf­sicht durch­ge­führt wird.

Muta­ti­ons­spe­zi­fi­sche SARS-CoV-2-PCR

Die muta­ti­ons­spe­zi­fi­sche PCR stellt eine beson­dere Form der SARS-CoV-2-PCR dar. Dabei wer­den SARS-CoV-2-posi­tive Pro­ben gezielt auf für Vari­an­ten typi­sche Muta­tio­nen unter­sucht. Wer­den neue Vari­an­ten von SARS-CoV‑2 beschrie­ben und von der WHO als rele­vant ein­ge­stuft, wer­den die für sie typi­schen Mani­fes­ta­tio­nen ver­öf­fent­licht und die Behör­den emp­feh­len deren stan­dard­mä­ßige Tes­tung. Die muta­ti­ons­spe­zi­fi­sche SARS-CoV-2-PCR erlangte beson­ders im Zuge des Auf­tre­tens von neuen „besorg­nis­er­re­gen­den“ Virus­va­ri­an­ten (Vari­ants of Con­cern – VOC wie zuletzt Delta oder Omi­kron) beson­dere Bedeu­tung für die Virus-Surveillance.

Aus tech­ni­schen Grün­den ist für eine muta­ti­ons­spe­zi­fi­sche PCR eine höhere Virus­last in der Probe erfor­der­lich als bei der PCR, die aus­schließ­lich zum Nach­wies von SARS-CoV‑2 dient. Es kann also sein, dass eine Probe in der SARS-CoV-2-PCR zwar posi­tiv ist, die muta­ti­ons­spe­zi­fi­sche PCR aber nicht aus­ge­wer­tet wer­den kann. Steht der Betrof­fene eher am Beginn einer Erkran­kung und die Virus­last steigt an, ist die Bestim­mung der Vari­ante nach weni­gen Tagen durch eine neu­er­li­che Mate­ri­al­ab­nahme und Ana­lyse möglich.

Aktu­elle SARS-CoV-2-RT-qPCR-Testsysteme

Das Ange­bot für SARS-CoV-2-Test­sys­teme ist im Ver­gleich zu Tests für andere Infek­ti­ons­er­re­ger enorm groß und viel­fäl­tig. In Öster­reich waren vom Früh­jahr 2020 bis Herbst 2021 mehr als 100 ver­schie­dene Typen von Test-Sys­te­men (Kom­bi­na­tio­nen von Reagen­zien und PCR-Platt­for­men) im Ein­satz; nur wenige davon sind POCT-Sys­teme. Im Rah­men von exter­nen Qua­li­täts­kon­trol­len der ÖQUASTA (Öster­rei­chi­sche Gesell­schaft für Qua­li­täts­si­che­rung und Stan­dar­di­sie­rung medi­zi­nisch-dia­gnos­ti­scher Unter­su­chun­gen) wie­sen 70 Test­sys­teme kein ein­zi­ges falsch nega­ti­ves Ergeb­nis aus. Andere erga­ben wenige oder einige, ver­ein­zelte Test-Sys­teme auch 100 Pro­zent falsch nega­tive Ergebnisse.

Falsch posi­tive Ergeb­nisse gab es ver­ein­zelt; in Summe aber deut­lich unter einem Prozent.

Post­ana­ly­tik: Inter­pre­ta­tion der PCR

Ein posi­ti­ves PCR-Test­ergeb­nis gilt als Nach­weis von SARS-CoV‑2 im Pro­ben­ma­te­rial, denn nur bei Vor­han­den­sein von Virus-Genom in der Probe ist eine Ampli­fi­ka­tion der Virus-Ziel­se­quenz mög­lich. Umge­kehrt schließt jedoch ein nega­ti­ves Ergeb­nis eine Infek­tion der unter­such­ten Per­son nicht aus, da meh­rere Fak­to­ren auf die Qua­li­tät des Pro­ben­ma­te­ri­als Ein­fluss haben und zu falsch nega­ti­ven Ergeb­nis­sen füh­ren kön­nen. Zu die­sen Fak­to­ren zäh­len das Ver­hal­ten der Per­son von der Pro­ben­ab­nahme (Mund­spü­lung), die nicht stan­dar­di­sierte Pro­ben­ab­nah­me­tech­nik sowie die Behand­lung des Pro­ben­ma­te­ri­als von der Abnahme bis zur Unter­su­chung. Aus die­sen Grün­den bedeu­tet sowohl bei asym­pto­ma­ti­schen Per­so­nen als auch bei sym­pto­ma­ti­schen Pati­en­ten ein nega­ti­ves Ergeb­nis der SARS-CoV-2-PCR nicht den siche­ren Aus­schluss einer SARS-CoV-2-Infektion.


HINWEIS: Labor-Ergeb­nisse müs­sen immer in Zusam­men­schau mit der Kli­nik und allen­falls mit bild­ge­ben­den Ver­fah­ren und SARS-CoV-2-Anti­kör­pern behan­delt werden.


Die Situa­tion der Pan­de­mie bedingt, dass der falsch nega­tive Befund das kri­ti­sche Ereig­nis dar­stellt – nicht der falsch posi­tive. Der falsch posi­tive Befund ist für die ein­zelne Per­son unan­ge­nehm, weil dar­aus per­sön­li­che Kon­se­quen­zen ent­ste­hen, die aber durch Wie­der­ho­lung einer Bestim­mung limi­tiert wer­den kön­nen. Bei falsch nega­ti­ven Ergeb­nis­sen besteht im Pro­zess eine sehr geringe Ent­de­ckungs­wahr­schein­lich­keit. Die meis­ten Feh­ler, die im Zuge der prä­ana­ly­ti­schen Maß­nah­men gesche­hen kön­nen, haben nega­tive Befunde zur Folge.

Aus­sa­ge­kraft von Ct-Werten

Zusam­men mit einem posi­ti­ven SARS-CoV-2-Test­ergeb­nis wer­den bei einem PCR-Befund übli­cher­weise auch die Ct-Werte ange­führt. Da meh­rere Tar­gets erfasst wer­den, wird ent­we­der für jedes ein­zelne der Ct-Wert ange­ge­ben (also meh­rere auch von­ein­an­der gering unter­schied­li­che Ein­zel­werte) oder es wird der Mit­tel­wert aus meh­re­ren Tar­get-spe­zi­fi­schen Ct-Wer­ten errech­net, wie es voll­au­to­ma­ti­sche Sys­teme machen.


HINWEIS: Da der Ct-Wert umge­kehrt pro­por­tio­nal zur Anzahl der Viren im Unter­su­chungs­ma­te­rial ist, zeigt ein hoher Ct-Wert eine nied­rige Virus­last und ein nied­ri­ger Ct-Wert eine hohe Virus­last an.


Zwei Fak­to­ren beein­flus­sen den Ct-Wert einer Probe wesent­lich: die Qua­li­tät der Pro­ben­ge­win­nung und die Qua­li­tät des Ana­ly­se­ver­fah­rens. Die Pro­ben­ge­win­nung erfolgt nicht stan­dar­di­siert: Weder mit­tels Abstrich­tup­fer noch beim Gur­geln wird ein ein­heit­li­ches Volu­men des Nasen-Rachen-Sekrets auf­ge­nom­men. Ebenso haben der Ort der Pro­ben­ent­nahme (Nasen­raum, Nasen­ra­chen, Rachen) und die Dauer des Kon­takts des Abstrich­tup­fers mit der Schleim­haut wesent­li­chen Ein­fluss auf die Zusam­men­set­zung des Pro­ben­ma­te­ri­als und somit auf die darin ent­hal­tene Virus­last. Dazu kommt als zusätz­li­cher Unsi­cher­heits­fak­tor, dass Ct-Werte spe­zi­fisch für Test-Sys­teme sind, das heißt: dass für die­selbe Probe von unter­schied­li­chen Test­sys­te­men deut­lich unter­schied­li­che Ct-Werte ange­ge­ben wer­den. Bei den meis­ten Test­sys­te­men ist die Repro­du­zier­bar­keit der Ct-Werte (zwei­ma­lige Bestim­mung in der glei­chen posi­ti­ven ­Probe) hin­ge­gen gut.

Seit Ende 2020 sind stan­dar­di­sierte Mate­ria­lien mit bekann­ter Anzahl von Viren pro Vol­ums­ein­heit ver­füg­bar. Anhand derer kön­nen die Ct-Werte von Pro­ben in eine ori­en­tie­rende Anzahl darin ent­hal­te­ner Viren umge­rech­net wer­den. Das ermög­licht die Ver­gleich­bar­keit von quan­ti­ta­ti­ven Ergeb­nis­sen unter­schied­li­cher PCR-Systeme.

Abnah­me­ver­fah­ren und Abnah­me­tech­ni­ken kön­nen jedoch nicht stan­dar­di­siert wer­den. Somit bleibt ein wesent­li­cher Unsi­cher­heits­fak­tor zur Quan­ti­fi­zie­rung der Virus­last beim Pro­ban­den bezie­hungs­weise auf sei­ner Nasenrachen-Schleimhaut.


HINWEIS: Auch das beste Labor­ver­fah­ren kann schlech­tes Pro­ben­ma­te­rial nicht kompensieren.

Quelle:
Gries­ma­cher et al, Ana­ly­ti­sche, dia­gnos­ti­sche und recht­li­che Aspekte der SARS-CoV-2-­PCR, DAG 1/​2022, S 3ff.; gekürzte Version.

© Öster­rei­chi­sche Ärz­te­zei­tung Nr. 07 /​10.04.2022