Die in allen Körperflüssigkeiten enthaltenen extrazellulären Vesikel werden sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen freigesetzt. Mikrovesikel, Exosomen und apoptotische Körperchen spielen u.a. bei der Gerinnung und Immunmodulation eine Rolle.
Viktoria Weber et al.*
Für alle multizellulären Organismen ist der Austausch von Informationen zwischen Zellen von zentraler Bedeutung. Die interzelluläre Kommunikation kann durch direkten Zell-Zell-Kontakt, durch lösliche Faktoren oder durch Membran-umhüllte Vesikel – sogenannte extrazelluläre Vesikel – erfolgen.
Zellen setzen sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen extrazelluläre Vesikel frei. Diese sind in allen Körperflüssigkeiten – etwa im Blut, im Harn, im Speichel, in der Muttermilch oder in der Tränenflüssigkeit nachweisbar und für die Analyse zugänglich. Extrazelluläre Vesikel wurden erstmals in den 1960er Jahren beschrieben. Insbesondere wurde beobachtet, dass Blutplättchen nach ihrer Aktivierung submikroskopisch kleine Partikel ins Blut abgeben. Diesen Partikeln wurde allerdings keine wesentliche biologische Bedeutung zugeschrieben, weshalb man sie auch als „Plättchenstaub“ bezeichnete. Erst Mitte der 1990er Jahre wurde erstmals die immunmodulierende Rolle dieser Vesikel beschrieben und ihre Bedeutung als Überträger von Informationen zwischen Zellen erkannt. Dies entfachte das Interesse an der Erforschung ihrer vielfältigen Rollen und ließ ihr großes Anwendungspotential für Diagnostik und Therapie erkennbar werden.
Klassifizierung und Biogenese
Extrazelluläre Vesikel bilden eine heterogene Gruppe von Vesikeln in einem Größenbereich von etwa 30 bis 5.000 Nanometer, die von einer Membrandoppelschicht umgeben sind. Anhand ihrer unterschiedlichen Biogenese unterscheidet man drei Gruppen:
1) Mikrovesikel werden von der Zellmembran abgeschnürt, tragen negativ geladene Lipide wie Phosphatidylserin an ihrer Oberfläche und besitzen eine Größe von 100 bis 1.000 Nanometer.
2) Exosomen stammen aus dem Zellinneren und weisen mit zehn bis 100 Nanometer einen geringeren Durchmesser auf.
3) Apoptotische Körperchen werden beim kontrollierten Zelltod gebildet. Sie werden ebenfalls von der Zellmembran abgeschnürt und haben eine Größe von mehr als einem Mikrometer.
Eine eindeutige analytische Unterscheidung dieser drei Populationen allein anhand ihrer Größe oder ihrer Oberflächenmoleküle ist aufgrund ihrer stark überlappenden Eigenschaften mit dem derzeitigen Stand der Technik nicht möglich. Daher schlagen die internationalen Fachgesellschaften ISEV (International Society for Extracellular Vesicles), ISTH (International Society on Thrombosis and Hemostasis) sowie die ISAC (International Society for the Advancement of Cytometry) für diese drei Gruppen die Verwendung des Sammelbegriffs „Extrazelluläre Vesikel“ vor.
Gezielte Beladung
Die Beladung extrazellulärer Vesikel mit funktionellen Molekülen erfolgt gezielt. Dieses spezifische Beladen von Exosomen mit Proteinen, Lipiden, Enzymen, DNA sowie mit verschiedenen Formen von RNA (rRNA, tRNA, mRNA, miRNA) kann über den ESCRT-Komplex (endosomal sorting complexes required for transport) beziehungsweise über akzessorische Proteine vermittelt werden oder aber davon unabhängig erfolgen, wobei die Mechanismen, welche der gezielten Beladung zugrunde liegen, noch Gegenstand der Forschung sind. Neben dem Transport von Molekülen in ihrem Inneren können extrazelluläre Vesikel auch an ihrer Oberfläche Proteine binden und diese an ihre jeweiligen Zielzellen weitergeben. Es gibt Hinweise darauf, dass Proteine durch die Bindung an Vesikeloberflächen ihre Konformation und damit auch ihre funktionellen Eigenschaften ändern können.
Charakterisierung
Die Anreicherung, Reinigung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln erfordert besondere Sorgfalt bei der Probennahme, Probenaufbereitung und Analyse, um Artefakte zu vermeiden und vergleichbare sowie reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die ISEV empfiehlt in ihren Richtlinien die Verwendung einer Kombination verschiedener Marker und Methoden zur Charakterisierung der Vesikel, um ihrer Heterogenität gerecht zu werden. Zu den am besten etablierten Verfahren zählen die Durchflusszytometrie, die dynamische Lichtstreuung, sowie die hochauflösende konfokale Mikroskopie und die Kryoelektronenmikroskopie, letztere insbesondere zur Darstellung einzelner Vesikel.
Die Durchflusszytometrie erlaubt – etwa in Blut- oder Plasmaproben – die Charakterisierung von Vesikeln ohne vorhergehende Isolierung. Dies bietet den wesentlichen Vorteil, dass durch die Aufreinigung bedingte Verluste oder Artefakte weitgehend vermieden werden können und dass die Interaktion von Vesikeln mit Zellen auf direktem Weg untersucht werden kann. Darüber hinaus sind damit an Hand von Markern Rückschlüsse auf die jeweilige zelluläre Herkunft der Vesikel möglich. Limitierender Faktor ist die Detektionsgrenze, die mit dem derzeitigen Stand der Technik bei etwa 200 Nanometer liegt, sodass kleinere Vesikel – und damit ein Großteil der Exosomen – auf direktem Weg nicht durchflusszytometrisch charakterisiert werden können. Lösungsansätze bestehen hier zum einen in der Immobilisierung von Exosomen auf magnetischen Trägerpartikeln, die Antikörper gegen Exosomenmarker wie CD9, CD63 oder CD81 tragen, und der durchflusszytometrischen Charakterisierung der auf den Trägerpartikeln gebundenen Exosomen. Zum anderen können fluoreszenzmarkierte Exosomen so viel Licht erzeugen, dass dies als Entscheidungskriterium für die Bestimmung der Partikel herangezogen wird und somit auch Exosomen, die kleiner als 200 Nanometer sind, bestimmt werden können.
Vorteile durch Kryoelektronenmikroskopie
Die dynamische Lichtstreuung oder Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) nutzt die Brown´sche Molekularbewegung zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel. An Vesikeln gestreutes Laserlicht wird mikroskopisch erfasst. Vom Weg, den ein Partikel über die Zeit zurücklegt, kann auf seine Größe rückgeschlossen werden. Mittels NTA können Größenverteilung und Partikelkonzentration bestimmt werden, wobei die Streulichtmessung jedoch alle in der Probe vorhandenen Partikel – also beispielsweise auch Lipoproteine oder Proteinaggregate erfasst – und somit nicht spezifisch für extrazelluläre Vesikel ist.
Die hochauflösende konfokale Mikroskopie ermöglicht nach geeigneter Färbung die Darstellung einzelner Vesikel beziehungsweise die Untersuchung von Zell-Vesikel-Interaktionen. Annähernd unverändert in Form und Größe bleiben extrazelluläre Vesikel beim Verfahren der Kryoelektronenmikroskopie, bei dem ein rasches Einfrieren und die Analyse im gefrorenen Zustand die morphologischen Charakteristika der Vesikel bis hin zu ihrer Lipiddoppelschicht weitgehend konserviert.
Unter den vielfältigen Rollen extrazellulärer Vesikel sollen hier zwei ihrer Eigenschaften – die gerinnungsfördernden sowie die immunmodulierenden Funktionen – näher beleuchtet werden. Die gerinnungsfördernde Aktivität extrazellulärer Vesikel unter physiologischen Bedingungen beruht auf ihrer Expression von Phosphatidylserin an der Oberfläche. Dieses bindet über seine negative Ladung Ca++ und ermöglicht so die Bindung und Interaktion von Gerinnungsfaktoren, insbesondere die Assemblierung des Tenase- und des Prothrombinase-Komplexes auf der Vesikeloberfläche, wodurch der Ablauf der Gerinnung katalysiert wird. Unter inflammatorischen Bedingungen verstärkt darüber hinaus die Expression von Tissue Factor insbesondere auf monozytären oder endothelialen extrazellulären Vesikeln deren gerinnungsfördernde Eigenschaften. Dies gilt auch für extrazelluläre Vesikel bei Tumorpatienten, bei denen in mehreren Studien eine signifikant höhere Expression von Tissue Factor nachgewiesen wurde als in gesunden Probanden. Der verstärkten Freisetzung von zirkulierenden extrazellulären Vesikeln aus aktivierten Plättchen kommt weiters bei der Verbrauchskoagulopathie im Rahmen einer Sepsis entscheidende Bedeutung zu. Daher können extrazelluläre Vesikel auch als diagnostische Marker dienen. Dieser Fragestellung widmen sich aktuelle Forschungsprojekte am Department für Biomedizinische Forschung der Donau-Universität Krems, die unter anderem untersuchen, ob die Assoziation von extra-zellulären Vesikeln mit bestimmten Faktoren (Tissue Factor, C‑reaktives Protein, Kompeementfaktoren) als Ergänzung zur Pathogendetektion mit herkömmlichen Methoden Hinweise auf eine systemische Infektion geben kann. Die Assoziation von extrazellulären Vesikeln mit dem Akutphasenprotein CRP ist zum Beispiel bei der Sepsis, der rheumatoiden Arthritis, oder bei Myokardinfarkt nachgewiesen und ist ein Beispiel dafür, dass Proteine durch die Bindung an Vesikeloberflächen ihre Funktionalität ändern können. Das aus fünf identischen Untereinheiten bestehende CRP-Molekül fungiert in freier Form als „pattern recognition molecule“, das apoptotische beziehungsweise nekrotische Zellen oder Pathogene bindet und die Aktivierung des Komplementsystems induziert. Bei der Ablagerung im Gewebe oder bei der Bindung an Vesikel kommt es jedoch zu einer Konformationsänderung von CRP. Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass Vesikel-gebundenes CRP proinflammatorische Eigenschaften aufweist. So konnte an der Donau-Universität Krems bei Stimulation von Monozyten mit CRP-tragenden Vesikeln aus dem Plasma von Sepsis-Patienten in vitro proinflammatorische Aktivierung nachgewiesen werden, die durch die Vorbehandlung des Plasmas mit einem CRP-spezifischen Adsorber deutlich verringert werden konnte. Extrazelluläre Vesikel könnten somit als Transportvehikel für CRP fungieren und zur Entwicklung und Verbreitung von lokalen Entzündungen beitragen.
Im Hinblick auf die immunmodulierenden Eigenschaften von extrazellulären Vesikel beschäftigt sich das Team an der Donau-Universität Krems vor allem mit der Frage, ob extrazelluläre Vesikel, die von Plättchen in der Zirkulation freigesetzt werden, zur Veränderung der Verteilung von Monozyten-Subtypen im Sinne einer Verschiebung von klassischen CD14++CD16-Monozyten hin zu pro-inflammatorischen intermediären (CD14++CD16+) und nicht-klassischen (CD14+CD16++) Monozyten beitragen und auf diese Weise Entzündungsvorgänge verstärken können.
Literatur bei den Verfassern
*) Univ. Prof. Dr. Viktoria Weber, Tanja Eichhorn, Birgit Fendl, René Weiss, Andreas Spittler
Department für Biomedizinische Forschung, Donau-Universität Krems, Dr.-Karl-Dorrek-Straße 30, 3500 Krems, Österreich
Core Facility für Durchflusszytometrie & Universitätsklinik für Chirurgie, Medizinische Universität Wien, 1090 Wien, Österreich
Österreichische Gesellschaft für Extrazelluläre Vesikel (ASEV)
Extrazelluläre Vesikel stellen ein äußerst dynamisches Forschungsfeld dar – sowohl hinsichtlich ihrer grundlegenden Wirkmechanismen als auch hinsichtlich ihrer möglichen Anwendungen in Diagnostik und Therapie. Um Forschungsgruppen auf diesem Gebiet österreichweit zu vernetzen, erfolgte im Jahr 2016 die Gründung der „Österreichischen Gesellschaft für Extrazelluläre Vesikel“ (www.asev.at), die mit jährlichen wissenschaftlichen Tagungen sowie regelmäßigen Workshops zu Methoden und Charakterisierungsverfahren den wissenschaftlichen Austausch auf nationaler, aber auch internationaler Ebene fördern möchte. Die kommende Jahrestagung findet im Frühjahr 2021 in Krems statt.
© Österreichische Ärztezeitung Nr. 17 /10.09.2020